Parmi les tests qui participent au diagnostic de la syphilis, nous avons le Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA). Après avoir exploré son intérêt, nous étudierons la technique de prélèvement, son principe, sa procédure, et nous ferons l’interprétation et l’analyse des résultats potentiels.

 Sommaire

• Intérêt biologique du TPHA
• Technique de prélèvement du TPHA
• Principe du TPHA
• Procédure du TPHA
• Lecture du résultat
• Expression, interprétation et analyse des résultats

Intérêt biologique du TPHA

La syphilis est une maladie vénérienne. Elle évolue selon trois phases distinctes avec des phases sans symptômes pendant lesquelles seul le diagnostic sérologique permet de la détecter. Dans sa phase terminale, elle peut engager le pronostic vital, ou tout au moins des troubles neurologiques et cardiovasculaires.

La syphilis est causée par la bactérie Treponema pallidum (tréponème pâle). C’est une bactérie Gram négative  spiralée et mobile. Elle provoque l’apparition, entre autres, d’anticorps spécifiques, détectables par le  TPHA. Couplé au dosage du VDRL (Venereal Disease Research Laboratoratory), le TPHA permet de faire le diagnostic de la syphilis.

Technique de prélèvement du TPHA

Le TPHA peut être effectué sur sérum, sur plasma ou liquide céphalo-rachidien [3].

Nous avons choisi d’étudier la procédure avec sérum. Celui-ci ne doit pas être hémolysé, ni présenter de turbidité (capacité d’un liquide à absorber ou diffuser la lumière incidente, étant ainsi trouble). Il ne doit pas être lipémique (c’est le cas si l’on ne peut lire du papier imprimé au travers).

Pour obtenir du sérum :

• Prélever du sang veineux dans un tube sec selon les normes
• Laisser coaguler le sang total à température ambiante pendant au moins 20 minutes ou centrifuger à 3000 tr/min pendant 5 minutes dès que le culot est pris.
• Transférer le sérum dans un autre tube (tube eppendorf par exemple) et étiqueter le tube.

Si le test n’est pas exécuté dans les 4 heures, réfrigérer le sérum à 2-8 °C. Si le test n’est pas exécuté dans les 5 jours, le congeler à -20°C.  L’on doit laisser revenir le sérum à température ambiante (23-30°C) avant le test. Il faut toujours vérifier qu’il ne présente pas de débris avant le test.

Pour un exemple de procédure de prélèvement sanguin veineux, bien vouloir lire l’article suivant.

Principe du TPHA

Principe de la réaction d’agglutination

Le TPHA repose sur une réaction d’agglutination passive. Dans une telle réaction, les antigènes, normalement solubles, sont rendus particulaires par fixation à un support. Dans le cas du TPHA, l’antigène engagé dans la réaction est fixé sur des hématies aviaires par traitement à l’acide tannique [1].

En 1er, il s’agit de mélanger le sérum à tester dans un puits d’une microplaque de titration à un diluant qui détache les anticorps hétérophiles. C’est-à-dire ceux qui peuvent se lier aux hématies animales, pouvant ainsi causer des réactions croisées. De plus, le fait de diluer ainsi le sérum enlève, bloque ou absorbe les anticorps anti-tréponèmes non pathogènes pouvant eux aussi causer des réactions croisées. Puis l’on mélange cette dilution aux hématies aviaires auxquelles les antigènes ont été fixés. L’on incube le mélange pendant 45 à 60 minutes.

Principe de lecture du résultat

S’il y a agglutination (voile au fond du puits de la plaque) alors le patient a des anticorps contre T. pallidum. La réaction est positive.

Si les hématies ne s’agglutinent pas et se déposent en bouton compact au fond du puits, alors le patient ne possède pas les anticorps recherchés. La réaction est négative.

Si le mélange présente un voile lors de cette phase qualitative, l’on peut passer à la titration des anticorps du sérum du patient. C’est la phase quantitative. Il s’agit de faire une dilution en série du sérum, puis de le mélanger aux hématies-test, jusqu’à l’obtention d’une agglutination nulle du mélange.

L’on obtient le titre en multipliant l’inverse du facteur de dilution du dernier mélange positif par le seuil de dépistage du kit du fabricant du test.

Procédure du TPHA

Matériels

• Microplaque de titration à 96 puits à fond en U, qui permet un pipetage facile et libre de résidus;
• Micropipette pouvant distribuer des volumes de 10, 25, 75 et 190µL;
• Gants à usage unique;
• minuteur;
• Solution décontaminante pour y jeter les cônes.

  Réactifs

Selon le kit [3], nous comptons parmi eux :

• Le tampon de dilution : c’est un diluant. Il sert à prédiluer les spécimens. Il contient un extrait de tréponèmes de Reiter qui ont pour rôle d’absorber les anticorps de tréponèmes non pathogènes;
• Cellules-test : érythrocytes aviaires stabilisées à l’eau formolée, auxquelles sont fixés des antigènes de T. pallidum (souche de Nichols).
• Cellules-contrôle : érythrocytes aviaires stabilisés. Des antigènes n’y sont pas fixés.
• Contrôle positif : serum predilué au 1/20, titré à 1/640 .
• Contrôle négatif : sérum humain prédilué au 1/20, exempt d’anticorps contre T. pallidum.

Étapes techniques

Méthode qualitative

Prévoir 3 puits de la microplaque par échantillon. Dans cet ordre, il faut :

1. Ramener chacun des composants du kit à température ambiante. De même que les échantillons si nécessaire.
2. Avec la micropipette, déposer 190µL de tampon de dilution dans le puits A.
3. Déposer 10µL de sérum dans le puits A avec un nouveau cône.
4. A l’aide d’une micropipette, mélanger le contenu du puits A et transférer 25µL de cette dilution 1/20 dans les puits B et C.
5. Remettre en suspension par retournement les cellules-test et contrôle
6. Ajouter 75µL de cellules contrôle dans le puits B
7. Ajouter 75µL de cellules-test dans le puits C
8. Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits
9. Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière de la chaleur et de toutes sources de vibrations
10. Incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.

Ceux-ci sont stables pendant 24 heures si la plaque est couverte et si les precautions énoncées ci-dessus ont été respectées. Pour les contrôles positifs et négatifs, il faut suivre les mêmes manipulations que pour l’échantillon.

Méthode semi-quantitative

Prévoir 5 puits supplémentaires par patient. A numéroter de D à H. Les sérums contrôle positif et négatif peuvent ne pas être testés, puisqu’ils l’ ont déjà été.

Il faut procéder ainsi :

• A l’aide d’une micropipette,  distribuer 25 µL de tampon dans les puits D à H.
• Transférer 25µL de sérum précédemment dilué au 1/20 dans le puits D et mélanger en aspirant et refoulant.
• Prélever 25µL de sérum dilué au 1/40 du puits D et le déposer dans le puits E. Mélanger encore et faire la même chose pour les puits F, G, H. Prélever 25µL du mélange du puits H et le jeter.
• S’assurer que les cellules-test sont bien remises en suspension. Ajouter 75µL de ces cellules dans les puits D à H inclus, successivement. Ceci conduit aux dilutions suivantes :

puits	D	E	F	G	H
dilution	1/160	1/320	1/640	1/1280	1/2560

• Homogeneiser mécaniquement le contenu des puits (ou manuellement) en tournant la plaque en cercles
• Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et des vibrations.
• Incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.

Les résultats sont stables pendant 24 heures si la plaque est couverte et les precautions suscitées ont été prises.

Facteurs qui influencent la technique

Parmi ces facteurs, nous pouvons dégager :

• La propreté désireuse de la microplaque si elle a été recyclée et mal nettoyée peut affecter la reaction antigène-anticorps. Il faut donc s’assurer de sa propreté.
• La bonne conservation des réactifs : à 2-8°C et à l’abri de la lumière. Ils ne doivent pas atteint leur date de péremption.
• Le technicien ne doit pas mélanger les réactifs de différents lots [3].

 Limites de la procédure et propositions pour surmonter ces limites 

Si l’agglutination dans la série des cellules-contrôle est supérieure ou égale à celle de la série des cellules-test, alors, la réaction est non-spécifique. La procédure ci-dessous doit être appliquée [3] :

1. Transférer 100µL de sérum à tester dans un petit tube puis ajouter 400µL de cellules-contrôle.Ensuite, bien mélanger, et laisser incuber pendant une heure.
2. Centrifuger 15 minutes à 1000 tpm et tester le surnageant avec la méthode qualitative. Le spécimen est ainsi dilué au 1/5. Nous prenons cela en compte pour les futures manipulations lors du passage à la quantification.

Si le test est à nouveau non spécifique, il faut faire un autre test, alternatif ou complémentaire et non le TPHA.

Lecture du résultat

Les résultats potentiels sont les suivants:

Lors de la quantification, le sérum doit arrêter d’être dilué dès obtention d’un résultat négatif.

Expression, interprétation et analyse des résultats

Expression des résultats

Le titre correspond à la plus forte dilution conduisant à une agglutination. Le compte rendu de résultat indique généralement la positivité ainsi que ce titre et les valeurs de référence.

Interprétation des résultats

Les anticorps developpés apres une syphilis peuvent persister apres guérison. C’est pourquoi un TPHA positif peut indiquer une infection présente ou passée. Dans ce cadre, il faut interpréter les résultats du TPHA en les complétant avec ceux du VDRL et éventuellement du FTA-ABS tel que suit [2] :

VDRL –	TPHA –	sérologie est négative (1)	N’exclut pas le diagnostic de syphilis débutante
VDRL-	TPHA +	syphilis traitée(2)	Le FTA est en général négatif, ou faiblement positif (FTA=<400)
VDRL+	TPHA+	Syphilis non traitée ou traitée tardivement(3)	Les 3 marqueurs VDRL, TPHA et FTA sont à des taux variables selon le stade de l’infection
VDRL+	TPHA-	Syphilis primaire (chancre) (4)	FTA positif
Faux positif en VDRL (anticorps anti-cardiolipidiques)	FTA négatif

Analyse des résultats

Cette analyse est essentiellement tirée de la ressource bibliographique [2].

(1): n’ exclut pas le diagnostic de syphilis précoce.

(2): ce groupe peut comporter également les patients ayant des réactions faussement positives. Ce peut être le cas chez les patients souffrant de lèpre, de mononucléose infectieuse ou de troubles du tissu conjonctif. Le test TPHA peut s’avérer aussi positif s’il ya des infections treponemiques non vénériennes comme le pian, le bejel, ou pinta. Les signes cliniques doivent donc être pris en considération.

(3): lorsque les taux d’anticorps sont élevés (par exemple VDRL>8 unités et TPHA >5120), le diagnostic est aisé, surtout si les signes cliniques sont évocateurs. Cependant pour un patient traité tardivement, le suivi sérologique devra mettre en évidence une diminution significative du VDRL (il est admis qu’une baisse du titre du VDRL de 4 fois en six mois est significative. Par exemple de 32 unités à 8 unités, soit de 2 dilutions).

(4): au stade de syphilis primaire, généralement nous avons le VDRL positif et le TPHA positif, mais le TPHA peut s’avérer négatif. Il faut alors effectuer le FTA, pour être sûr qu’il s’agit d’un faux positif pour le VDRL.

NB : en routine, les tests TPHA et VDRL sont réunis sous l’appellation de BW (Bordet et Wassermann). Le FTA-ABS nécessite l’utilisation d’un microscope à fluorescence. Il n’est pas pratiqué en routine.

Bibliographie

1.Acharya, T. (2016). TPHA:principle procedure results and its interpretation . Récupéré sur microbeonline: http://microbeonline.com/tpha-principle-procedure-results-and-interpretation/

2.Basse-Guerineau, A.-L. (n.d.). Diagnostic sérologique de la syphilis. Récupéré sur Institut de veille sanitaire francais: http://opac.invs.sante.fr/doc_num.php?explnum_id=5316

3.Biolabo. (2014). TPHA. Récupéré sur Biolabo: http://www.biolabo.fr/biolabo/pdfs/noticesFR/syphilisFR/FT%204500100%20TPHA.pdf

Avertissement: La procédure ci-dessus décrite est un exemple. Pour la rendre applicable dans votre laboratoire, elle doit être validée par votre directeur technique.

Les auteures:

-Rédigé par Renée A. LEYEBE, titulaire d’une Licence en Sciences de la Santé, option Analyses Médicales

-Validé par Petronile NGO ETOUNDE, titulaire d’un Master en Microbiologie et Immunologie.