Dans cet article, nous allons explorer comment mesurer manuellement les Temps de Quick (TQ) et de Cephaline Activé (TCA). Ce qui nous permettra de déduire le Taux de Prothrombine (TP) et de calculer l’International Normalized Ratio (INR). Nous allons bien sûr aussi explorer les techniques de pélèvement et principe de mesure.

Sommaire

• Intérêt biologique
• Principe TQ et TCA
• Technique de prélèvement
• Procédure de mesure des TQ et TCA
• Calcul de l’ INR et du taux de Prothrombine

Intérêt biologique

Le Temps de Quick et par conséquent le Taux de Prothrombine explorent la voie extrinsèque de la coagulation et accessoirement les étapes communes à la voie intrinsèque. La coagulation correspond à l’hémostase secondaire [1].

Le calcul de l’INR a pour but de normaliser les valeurs du TQ et TP. En effet leurs valeurs de référence peuvent varier selon le réactif utilisé et donc selon les laboratoires. En donnant une valeur comprise par tous, l’ INR permet d’adapter les dosages d’anticoagulants pour les patients en nécessitant l’administration.

Le TCA a pour but d’explorer la voie intrinsèque de la coagulation, et accessoirement les étapes communes à la voie extrinsèque.

 L’article dont elle a été tirée est consultable ici

Principe

Principe de mesure du Temps de Quick

Pour le TQ, il s’agit  de mesurer le temps de formation du caillot à partir  d’un plasma de patient:

• décalcifié (par l’usage de l’anticoagulant citrate de sodium);
• déplaquetté (par la centrifugation) et donc manquant de phospholipides et de facteur tissulaire.

Ces deux-là sont souvent réunis dans le corps humain sous la forme du facteur III, la thromboplastine et sont nécessaires au déclenchement de la coagulation par voie extrinsèque.

Concrètement, il s’agit d’incuber le réactif  (composé de facteur tissulaire, de phospholipides, de chlorure de calcium) à 37°C pendant au moins 15 mn. Puis d’incuber le plasma à tester afin de l’amener à 37°C pendant 3 minutes, puis d’y ajouter le réactif ( thromboplastine) afin de déclencher la coagulation.

On déclenche alors le chronomètre, et on vérifie le temps de formation du caillot à l’aide d’un crochet avec lequel on cherche le caillot dans le mélange réactionnel.

Principe de mesure du Temps de Cephaline Activé

Pour le TCA, il s’agit d’ajouter au plasma de patient décalcifié et déplaquetté (comme plus haut):

• Le réactif, composé d’un activateur de la voie intrinsèque (acide ellagique, kaolin, silice etc)  et de céphaline, un phospoholipide nécessaire à la coagulation;
• Puis après incubation à 37°C, on ajoute le chlorure de calcium, et l’on déclenche le chronomètre pour mesurer le temps de formation du caillot à l’aide d’un crochet avec lequel on cherche le caillot dans le mélange réactionnel.

Avant de mesurer les TQ et TCA du patient, il faut exécuter la procédure exactement de la même manière avec un plasma contrôle. Ceci a pour but, non seulement de vérifier l’intégrité du réactif, mais aussi, de disposer d’un témoin pour pouvoir calculer l’INR et avoir une valeur de référence pour le TCA.

Technique de prélèvement

De préférence le patient doit être à jeun.

Le sang sera prélevé dans un tube au citrate de sodium 3,2% soit 1 : 9 (1volume d’anticoagulant pour 9 volumes de sang donc 9NC). Eviter le prélèvement à la seringue qui favorise les micro-caillots. Pour une procédure de prélèvement veineux, voir l’article.

Il faut exécuter le test moins de 6h après la ponction veineuse pour un plasma ou sang total conservé à température ambiante ou à +4°C [2].

Procédure de mesure des Temps de Quick et de Cephaline Activé

Réactifs 

Nous avons  comme réactifs:

• Réactif de TQ; thromboplastine
• Réactif de TCA: cephaline + activateur de la voie intrinsèque
• CaCl₂
• Plasma contrôle

Matériel

Nous avons besoin de:

• 1 crochet : pipette pasteur en verre dont le bout a été recourbé à la flamme ;
• 2 tubes à hémolyse en plastic obligatoirement (le verre est un activateur de coagulation) ;
• Un chronomètre avec marquage de secondes ;
• Le bain-marie électrique réglé à 37°C ;
• Un portoir de tubes pour y poser le tube de sang du patient, et les tubes à hémolyse ;
• Papier hygiénique : pour essuyer le crochet (pour ne pas transporter le st réactionnel du test de TP, vers le mélange réactionnel du test de TCA) et les gouttes d’eau du bain-marie sur le tube à hémolyse car une goutte d’eau visible à travers le tube pourrait faire  croire que c’est du plasma coagulé ;
• Une paire de gants ;
• Une solution de décontamination;
• Cônes jaunes et bleus, avec un portoir de cônes ;
• Une pipette de 50µl et une de 100-200 µl, et une de 1000 µl ;
• Un marqueur ;
• Fiche de paillasse du patient et un stylo ;
• Une poubelle DASRI et à objets ménagers.

Mode opératoire

Préparation de la pailasse

• Laisser revenir l’aliquot de contrôle à température ambiante. Mettre à réchauffer les réactifs de TP et CaCl₂ dans le bain-marie à 37°C (prévoir un peu plus de 100 µl de réactif TP par échantillon, et un peu plus de 50 µl de CaCl₂ par échantillon pour la journée). L’on pourrait utiliser pour ces quantités des tubes secs étiquetés;
• Porter les gants ;
• Centrifuger le tube de sang citraté à 3000 tr/min pendant 5 minutes et le placer sur le portoir ;
• Etiquetter au marqueur deux tubes à hémolyse en plastic avec le code du patient et l’examen (TP ou TCA) les placer sur le portoir ;
• Déposer dans chaque tube 50 µl de plasma de patient ;
• Ajouter dans le tube TCA 50 µl de réactif de TCA que l’on vient de sortir du frigo. Le remettre au réfrigérateur tout de suite. Régler le minuteur sur 3 minutes. Mettre à incuber les 2 tubes à hémolyse dans le bain-marie. Déclencher le minuteur ;
• Pendant ce temps, régler les micropipettes 200 et 50 sur les volumes 100 et 50 µl  respectivement. Poser sur la paillasse,  papier hygiénique, crochet, cônes dans leur portoir et micropipettes.

Mesure des TQ et TCA

• Quand le minuteur sonne, ramener celui-ci à zéro.
• Ouvrir le bain-marie, et essuyer rapidement l’eau du tube à hémolyse TP du patient avec le papier hygiénique, y déposer 100 µl de réactif TP mis à incuber le matin, déclencher le minuteur, et fouiller rapidement le mélange réactionnel avec le crochet pour chercher le caillot tout en surveillant le chronomètre.
• Dès que le crochet prend, noter mentalement le temps, et arrêter le chronomètre.
• Reporter le TQ sur la fiche de paillasse. Ramener le minuteur à zéro. Essuyer le crochet avec le papier hygiénique.

De même:

• Ouvrir le bain-marie, et essuyer rapidement l’eau du tube à hémolyse TCA du patient avec le papier hygiénique, y déposer 50 µl de CaCl₂ mis à incuber préalablement, déclencher le minuteur, et fouiller rapidement le mélange réactionnel avec le crochet pour chercher le caillot tout en surveillant le chronomètre;
• Dès que le crochet prend, noter mentalement le temps, et arrêter le chronomètre. Reporter le TCA sur la fiche de paillasse. Ramener le minuteur à zéro. Essuyer le crochet avec le papier hygiénique.

• Avoir fait de même pour le contrôle qui a décongelé.

Calcul de l’ INR et mesure du Taux de Prothrombine

Pour calculer l’ INR, nous avons besoin de L’ISI. C’est l’ Indice de Sensibilité International. Ill est spécifique du réactif utilisé et figure généralement sur le coffret de réactif TP. De même, il n’est valable que pour ce coffret précis.

La formule suivante permet d’obtenir l’ INR: (TQ patient÷ TQ contrôle)^ISI.

Pour trouver le taux de Prothrombine, il est nécessaire d’ utiliser  la droite de Thivolle.

NB: la Droite de Thivolle

Elle est construite à partir des dilutions d’un pool de plasmas normaux en tampon Owren Koller.

En abscisse, on a les inverses de chaque dilution (1/d) et en ordonnée, on a les temps de coagulation obtenus en secondes.

Elle permet donc de tracer une droite d’étalonnage qui donne le taux de prothrombine en fonction du temps de coagulation obtenu du patient( temps de Quick).

Contrôle Qualité

Le contrôle est reconstitué à partir d’un plasma lyophilisé du fabricant.

Il peut aussi être préparé à partir d’un pool de plasmas de patients dont les valeurs de TQ et TCA étaient comprises dans les limites de valeurs de référence. Ces limites vont de 11 à 14 sec pour le TQ, et sont de 32± 2 sec pour le TCA.

Les plasmas choisis peuvent être mélangés  dans un pot en plastic stérile et  aliquotés dans des eppendorfs en fractions de 200 µl min puis congelés. Afin d’être utilisés individuellement.

Bibliographie

1.Bell Gwet. (2010). Hématologie (Vernazobres-Grego).

2.Salvagno, G.-L., Lippi, G., Montagnana, M., Franchini, M., Poli, G., & Guidi, G.-C. (2009). Influence of temperature and time before centrifugation of specimens for routine coagulation testing. International Journal of Laboratory Hematology, 31(4). Repéré à https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1751-553X.2008.01058.x

Avertissement: La procédure ci-dessus décrite est un exemple. Pour la rendre applicable dans votre laboratoire, elle doit être validée par votre directeur technique.

L’ auteure:

-Rédigé par Renée A. LEYEBE, titulaire d’une Licence en Sciences de la Santé, option Analyses Médicales

-Revu par Petronile NGO ETOUNDE, titulaire d’une Licence en Sciences de la Santé, option Analyses Médicales, et d’un Master en Microbiologie et Immunologie.