Comment faire la numération manuelle des réticulocytes

31 mai 2021
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Les réticulocytes sont globules rouges jeunes qui gardent pendant environ 1 jour, des restes d’ARN qui les font reconnaître, après coloration vitale, comme réticulocytes. La  procédure  peut être manuelle. Dans le texte qui suit, nous allons détailler d’abord  le principe, puis  la procédure technique de cette numération manuelle.

Sommaire

Intérêt  de la numération des réticulocytes

Sommairement, la numération des réticulocytes permet de caractériser l’anémie : régénérative, ou arégénérative. Et  de faire  l’évaluation de la réponse au traitement contre l’anémie, du suivi de patients aplasiques, ou dysplasiques, ou enfin ayant subi une greffe de moelle osseuse.

Technique de prélèvement

Pour faire une numération des réticulocytes, l’échantillon de sang peut être veineux ou capillaire. Pour les détails concernant la technique de prélèvement, voir l’article suivant.

Anticoagulants recommandés

Parmi les anticoagulants, l’ EDTA est le préféré . Dans ce cas, la stabilité des réticulocytes est de 8 jours, pour un échantillon conservé entre 2-8°C[1]. Cependant, si l’on utilise l’héparinate de lithium, alors la stabilité de l’échantillon est de 24h.  Mais, du sang capillaire frais peut être utilisé car, il y a du citrate de sodium, qui jouerait le rôle d’anticoagulant dans la préparation du bleu de cresyl.

Comme nous le verrons plus loin, le bleu de cresyl est le colorant utilisé pour visualiser et reconnaître les réticulocytes au microscope optique.

Pour un guide efficace du bon usage du microscope optique, voir cet article.

Principe de la numération  manuelle des réticulocytes

Elle repose sur la visualisation et le comptage des réticulocytes. L’on ramène ensuite ce nombre à la numération érythrocytaire pour donner le nombre en valeur absolue. C’est cela,  et non pas le pourcentage qui est préféré dans l’interprétation par le médecin.

Comment reconnaitre un réticulocyte au microscope

Le réticulocyte donnant un globule rouge par diminution de sa taille et perte de l’ARN résiduel, il a une taille et un volume légèrement supérieurs à ceux du globule rouge (110-125 fl et  8 µm de diamètre) et possède encore des mitochondries et des ribosomes.

Après coloration et précipitation de ses particules d’ARN avec certains colorants fluorescents ou des colorants basiques comme le bleu de méthylène, et le bleu de crésyl brillant, il devient reconnaissable parmi les érythrocytes. Ceux-ci ne présentent pas ces particules.

Colorant utilisé pour la visualisation des réticulocytes

C’est le bleu de crésyl brillant qui est utilisé. C’est un colorant vital, c’est-à-dire qu’il colore les cellules sans exercer d’action nocive ou létale immédiate. Il est orthochromatique lorsqu’il est appliqué sur des réticulocytes[2].

Technique de numération proprement dit

Matériel et réactifs

  • Colorant bleu de crésyl brillant : Il est composé de bleu de crésyl pur cristallisé (1g), d’eau physiologique (100 ml), et de citrate de sodium (0,1g).
  • Gants ordinaires.
  • 2 lames porte-objet et une lame à bord rodée.
  • Tube à hémolyse.
  • Boule de coton cardé
  • Etuve à 37°c (facultatif)
  • Microscope optique avec objectif × 10 et  × 100.
  • 2 pipettes pasteur avec tétine.
  • Poubelle biologique
  • Portoir pour tubes.
  • Minuteur.
  • Marqueur

Etapes techniques proprement dit

Il s’agit de :

  • Se laver les mains, enfiler les gants.
  • Mélanger dans un tube à hémolyse étiqueté 6-8 gouttes de sang bien homogénéisé, et 6-8 gouttes de réactif en les prélevant respectivement avec les pipettes pasteur.
  • Boucher le tube à hémolyse d’un bout de coton cardé et  le mettre l’étuve pendant 10-15 minutes. Remettre en suspension.
  • Tirer deux frottis très fin et réguliers. Sécher en agitant vivement à l’air.
  • Lire d’abord à l’objectif ×10, pour repérer une zone où la distribution des réticulocytes est homogène. Passer à l’objectif à immersion pour effectuer la numération.

Elle peut se faire de cette façon[3] :

compter le nombre de réticulocytes dans 100 champs : R.

Puis compter le nombre total de globules rouges dans 10 champs : G

 Enfin, pour le pourcentage  des réticulocytes, on a : %R = R/Gx10

Facteurs influençant la numération manuelle  

Plusieurs facteurs peuvent entraîner une numération inexacte. On peut avoir :

Au niveau de la numération :

  • Une mauvaise homogénéisation de l’échantillon ne permet pas une bonne numération;
  • Compter très peu de cellules (globules rouges) peut fausser le résultat. Un minimum de 500 cellules doit être adopté[4] ;
  • Le comptage du nombre de globules rouges  est pénible, d’où les risques  d’erreurs possibles. Et si l’on se contente d’estimer qu’il y a 100 globules rouges/champ, cela rend la méthode aléatoire, car la numération érythrocytaire est personnelle aux patients.

Ainsi, on peut constater que cette méthode de numération manuelle est de sensibilité et de reproductibilité aléatoire. Cependant, il est possible de surmonter cette faiblesse en faisant plusieurs comptages du même échantillon. On en tire  ensuite une moyenne, que l’on compare aux moyennes d’un 2nd technicien.

Au niveau des réactifs  et consommables

Nous avons par exemple:

  • En fonction des fabricants, les teintes des colorants pourraient  légèrement  varier, prêtant à confusion ;
  • Ne pas filtrer le colorant en début de manipulation peut causer la formation d’agrégats de celui-ci sur le frottis;
  • Une lame non dégraissée, non sèche, et rayée ne permet pas d’obtenir un frottis fin, homogène, qui rende la numération aisée, par une bonne répartition des cellules.

Au niveau de la technique proprement dit

  • D’abord, en tirant le frottis, un trop gros volume du mélange entraîne un frottis qui dépasse l’extrémité de la lame porte-objet ;
  • Ensuite, il peut y avoir confusion entre les réticulocytes et les corps de Heinz ;
  • Enfin,  une confusion entre les réticulocytes et les corps de l’hémoglobine H est également possible.

Les corps de Heinz sont des précipités d’hémoglobine causés par la déficience en glucose -6- phosphate déshydrogénase, pendant les crises hémolytiques.

Dans ce cas, comme moyen de les discriminer et ne pas fausser la numération des réticulocytes, l’on peut vérifier leur couleur et leurs granulations. En effet, ils sont  d’un bleu-violet légèrement plus clair que la réticuline des réticulocytes. Et leur aspect est en petits granules,  situés généralement en périphérie de la cellule, ou semblant traverser la membrane.

De plus,  ils ont des diamètres allant de 1 à 3mm. Et ils peuvent être présents en plusieurs exemplaires dans une même cellule [4] .

Les corps de l’hémoglobine H quant à eux, se présentent comme des points bleu pâle de tailles variables. Ils apparaissent dans l’alpha- thalassémie ou l’hémoglobinose H [4] .

Lecture du résultat  au microscope

Au microscope, les hématies apparaissent colorées en bleu-vert (ou orangé). Les réticulocytes contiennent des filaments et fines granulations en bleu-violet foncé, disposés en filet : la substance granulo-filamenteuse.

Il y a différents stades du réticulocyte. L’on peut les distinguer, une fois coloré, selon l’aspect de la structure granulo-filamenteuse. En microscopie optique, ces stades sont difficiles à distinguer les uns les autres. Ceux-ci n’ayant pas d’importance diagnostique, la numération des réticulocytes comprend tous ces stades à la fois [1].

Pour une image de ces stades et une interprétation détaillée des résultats potentiels, bien vouloir consulter l’article suivant.

Contrôle qualité

Les mesures de contrôle qualité peuvent différer comme toute procédure selon les laboratoires. Mais elles pourraient impliquer par exemple :

  • Une filtration du colorant avant usage ;
  •  Sa conservation au réfrigérateur, tout comme sa traçabilité (marquer le jour de préparation sur le flacon) ;
  • L’utilisation de lames contrôle pour s’assurer que le colorant utilisé n’induise pas en erreur
  •  Qu’en ce qui concerne le comptage, il soit  effectué par deux techniciens  différents. Et si leurs résultats ne diffèrent pas de plus de 20%, l’on peut considérer que le comptage est fiable [4].

  Autre technique de numération des réticulocytes

Nous avons la cytométrie de flux. C’est une technique qui utilise un marquage de l’ARN ribosomal par un fluorochrome et détecte le signal émis.

C’est une méthode d’une grande sensibilité, reproductibilité et précision. Elle permet même de distinguer facilement les différents stades de réticulocytes entre eux. Ce qui n’est pas le cas de la technique manuelle. Mais cette technique est plus coûteuse[5] .   

En définitive, l’on peut voir que faire la numération manuelle des réticulocytes est peu coûteuse, mais demande tout de même l’œil d’un microscopiste averti. La cytométrie de flux est une excellente alternative à son aspect quelque peu aléatoire. Mais elle est coûteuse. Dans un prochain article, nous parlerons essentiellement de l’analyse des résultats.

[1] Lupacchino, C. (2008, avril). La stabilité des réticulocytes. Récupéré sur docplayer: https://docplayer.fr/10172270-La-stabilite-des-reticulocytes.html

[2] Lecomte.2011). Bleu de Crésyl. Repéré à http:// usrers.skynet.be/champignos_passion/Bleude cresyl.htm

[3] Biologie tropicale.(2015).  Numération des reticulocytes. Repéré à http://www.bioltrop.fr/spip.php?article147

[4] Cheesbrough M. (2010).District Laboratory Practice In tropical countries.2nd edition Update.Part2.Cambridge University Press

[5] Alvarez, Chabert, Baufine-Ducrocq, & Quillert. (1997). Evaluation de la numération des réticulocytes sur automate Cell-Dyn 3500® : Comparaison avec une technique par cytométrie en flux. Annales de Biologie Clinique, 55(3), 215‑221

Avertissement: La procédure ci-dessus décrite est un exemple. Pour la rendre applicable dans votre laboratoire, elle doit être validée par votre directeur technique.

dans votre laboratoire, elle doit être validée par votre
directeur technique.

Les auteures:

-Rédigé par Renée A. LEYEBE, titulaire d’une Licence en Sciences de la Santé, option Analyses Médicales

-Validé par Petronile NGO ETOUNDE, titulaire d’un Master en Microbiologie et Immunologie.

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