« Comb » signifie en français « peigne ». C’est l’élément principal du kit portatif et pratique à utiliser Immunocomb, conçu pour la détection et la quantification d’antigènes ou d’anticorps. Comment fonctionne-t-il ? Comment l’utilise t-on ? Comment faire la validation technique avec cette méthode ?  Nous espérons répondre à ces questions sur l’intérêt, le principe et la procedure Immunocomb.

Nous allons utiliser le cas de la recherche d’ anticorps anti VIH1 et 2: Cas du Kit BISPOT

Cette méthode, nous pouvons déjà le dire a l’avantage d’être moins couteuse que faire le test par chaine ELISA, mais le principe est quasiment le même. Cependant, elle présente nombre d’inconvénients que nous allons détailler.

Sommaire

• Intérêt biologique
• Type d’ échantillon
• Principe de la méthode Immunocomb
• Procédure
  • Réactifs et matériel
  • Etapes techniques
• Lecture et interprétation des résultats
• Contrôle qualité
• Limites de la méthode Immunocomb

Intérêt biologique

La méthode immunocomb est un test sérologique qui permet de détecter et quantifier un antigène ou un anticorps présents dans du serum ou du plasma.

Elle est basée sur la technique ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), littéralement « dosage d’immunoadsorption par enzyme liée ». C’est-à-dire, un dosage immunoenzymatique sur support solide. En effet, cette technique entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassay), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par spectroscopie.

Nous allons étudier l’exemple du kit immunocomb II VIH 1 et 2 Bispot.

 Type d’échantillons

Généralement, le peigne immunocomb s’utilise avec du plasma ou du sérum. L’on peut avoir conservé ces derniers à +2-8°C pendant 7 jours. Si l’on veut les utiliser plus de 7 jours après, il faut les congeler (-20°C). Il faut éviter de congeler et décongeler répétitivement le sérum ou plasma. Pour une technique de prélèvement sanguin, voir l’article suivant.

Principe de la méthode Immunocomb

La méthode immunocomb repose sur deux principes : la chromatographie d’adsorption et l’immuno enzymatique.

La chromatographie d’adsorption est une technique qui permet de séparer les constituants d’un  mélange par l’entrainement de ces constituants au moyen d’une phase mobile (un fluide) le long d’une phase solide. Ici, le but étant de détecter les anticorps du sérum, ceux-ci seront entrainés puis se fixeront spécifiquement aux constituants de la phase solide (le peigne).

L’immunoenzymatique quant à elle, consiste à fixer un anticorps lié à un chromogène (enzyme) qui réagira avec un substrat et provoquera un changement de couleur. Ce changement signe la présence de la molécule affinitaire de l’anticorps.

Pour notre test VIH, notre phase solide (peigne à 12 dents) est sensibilisée à trois endroits sur chaque dent :

• Point supérieur : anticorps de chèvre contre les immunoglobulines humaines (contrôle interne)
• Point médian : peptides synthétiques du VIH 2
• Point inférieur : peptide synthétique du VIH 1.

La plaque réactive est constituée d’une rangée de six puits pour chaque patient et les contrôles (x12, puisque l’on a 12 dents). Chaque puits contient une solution réactive. Une dent sera trempée successivement dans chaque puits.

Pour mieux comprendre le principe, il faut voir ce qui se passe à chaque étape:

• Pour commencer, il faut insérer du sérum ou du plasma dans le puits A (1^er puits) puis l’on y trempera une dent du peigne. Les anticorps anti-VIH, s’ils sont présents dans le sérum, s’uniront spécifiquement aux peptides synthétiques des spots moyen et inférieur. Simultanément, les immunoglobulines du sérum seront capturées par les anticorps dirigées contre elles (spot supérieur, contrôle interne).

• La solution de lavage dans le puits B élimine les molécules non liées.
• Dans les puits C et D, les anticorps capturés vont réagir avec des anticorps secondaires antihumains marquées à la phosphatase alcaline (PA). Puis les molécules non liées seront éliminées par lavage en D et E.
• Enfin, en F, la Phosphatase alcaline liée réagit avec un substrat chromogène. Le résultat en est visible par l’apparition de couleur gris-bleu au niveau des spots.

Nous pouvons constater qu’ici nous avons affaire à une méthode ELISA en sandwich. L’anticorps recherché est pris en sandwich entre le peptide synthétique et l’anticorps secondaire marqué.

• La dernière étape de notre méthode est la lecture : une fois la couleur apparue, il faut comparer son intensité à celle de l’échelle couleur du « combscale » afin de quantifier les anticorps. Seulement, notre kit n’ en a pas, car c’est un test qualitatif.

Procédure

Réactifs et matériel

Nous avons  le sérum ou plasma des patients. Ainsi que le kit immunocomb dont la composition est telle que nous le montre le schéma suivant :

Figure : les différents composants d’un kit immunocomb [1]

A. peigne immunocomb, fait d’un gel plastifié. On peut utiliser le peigne entier ou en couper quelques dents pour le nombre d’échantillons à tester.

B. plaque de développement (contenant  du diluant d’échantillon dans la rangée A, une  solution de lavage dans la ligne B,  des anticorps de chèvre antihumains marqués  à la phosphatase alcaline dans les lignes C et D, une solution de lavage  dans la rangée E,  un substrat chromogène de BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphospate) et NBT(nito blue tetrazolium) dans la rangée F).

C. perforateur

D. contrôles positif (anticorps anti-vih 1 et anti-vih 2) et négatif (aucun anticorps),  (1 mL chacun).

E. CombScale calibré : échelle de couleur pour une lecture semi-quantitative. Nous devons notifier que le test VIH 1 et 2 BISPOT n’utilise pas de combscale car c’est un test qualitatif.

En plus l’on doit aussi avoir une paire de gants non stériles , une poubelle biologique,  des ciseaux, une minuterie, du  papier absorbant, un équipement de collecte des échantillons, une centrifugeuse, une pipette de précision capable  de distribuer 50µl. L’incubateur et l’agitateur sont optionnels.

Etapes techniques

• Sortir le kit du réfrigérateur et le laisser revenir à température ambiante

Mettre ses gants avant même d’ouvrir l’emballage du peigne car celui-ci contient des peptides du VIH. L’on peut couper seulement une dent du peigne pour un seul patient, et remettre le peigne dans son emballage, fermer par une pince et le remettre au réfrigérateur. Bien sûr même pour tester un seul patient, prévoir les dents pour les contrôles positif et négatif.

• Réaction antigène-anticorps : puits A

Perforer les puits A.Y introduire 50 µL du sérum de chaque patient, ainsi que le même volume de contrôles, mélanger par aspiration-refoulement. Insérer le peigne(écritures face à soi). Déclencher le chronomètre (10 minutes). Agiter le peigne de temps en temps. Deux minutes avant la fin du temps, perforer les puits B.

• Lavage n1 : puits B

Retirer le peigne des puits, l’égoutter en le tapotant légèrement contre le papier absorbant, en le tenant verticalement. Puis le plonger dans les puits B. Déclencher le chronomètre (2 minutes). Agiter vigoureusement le peigne dans les puits B durant au moins 10 secondes. Laisser reposer. Puis recommencer plusieurs fois pendant les  deux minutes de lavage. Perforer les puits C. A la fin du temps, retirer le peigne et le tapoter contre le papier absorbant.

• Liaison avec le conjugué : puits C

Insérer le peigne dans le puits C. Agiter le peigne comme dans le puits A. Déclencher le chronomètre pour dix minutes. Agiter le peigne à l’intérieur des puits de temps en temps. Perforer le papier aluminium des puits D. A la fin des dix minutes, retirer le peigne et l’égoutter par tapotement sur du papier absorbant.

• Incubation avec le conjugué : puits D

Insérer le peigne dans les puits D. Agiter comme dans le puits B. Laisser reposer pendant deux minutes, et pendant ce temps, perforer les puits E. A la fin du temps, retirer le peigne et l’égoutter contre du papier absorbant.

• Lavage n°2 : puits E

Insérer le peigne dans les puits E. Agiter. Laisser reposer deux minutes pendant que l’on perfore les puits F. A la fin du temps, retirer le peigne et l’égoutter contre du papier absorbant.

• Réaction colorée : puits F

Insérer le peigne dans les puits F. Agiter plusieurs fois. Déclencher le chronomètre (dix minutes). Agiter deux dois pendant cette incubation. Après le temps, retirer le peigne.

• Révélation puits E

Insérer le peigne dans les puits E. Après une minute, retirer le peigne et le laisser sécher à l’air avant de lire les résultats.

Lecture et interprétation du résultat

Les résultats sont visibles par des spots gris-bleu à la surface des dents du peigne.

Pour le contrôle positif, les trois spots sont colorés.

Pour le contrôle négatif, seul le spot supérieur est coloré.

Si le résultat est invalide, ou on observe aucun spot, l’on doit recommencer le test. Avec de nouveaux contrôles.

Compte-tenu de la similitude entre VIH 1 et 2, la possibilité d’une réactivité croisée des anticorps existe. Dans ce cas, l’on peut avoir une réaction positive pour les spots moyen et inférieur. Dans ce cas, l’on compare l’intensité des deux spots. La plus grande intensité indique le type de VIH. Si l’intensité est identique, l’on peut considérer la possibilité d’une coïnfection [2].

NB:

Un test positif à l’immunocomb ne doit pas être considéré comme un diagnostic de l’infection à VIH. Un test de confirmation est nécessaire par Western blot, pour rechercher l’ARN viral. Bien sur, il faut se situer dans l’algorithme de dépistage en vigueur dans chaque pays et même dans chaque laboratoire.

Généralement, les laboratoires des pays en voie de développement sont organisés en niveau périphérique, intermédiaire, et central. Et les algorithmes vont de pair avec les moyens mis à disposition de ces laboratoires et des régulations gouvernementales. Dans un article ultérieur, nous partagerons un algorithme de dépistage de l’infection à VIH en vigueur actuellement au Cameroun.

De même, un résultat de test négatif n’est pas une preuve de non-infection car la production d’anticorps après infection peut être retardée. Il faut refaire le test au moins trois semaines plus tard.

Contrôle qualité

D’après la fiche technique de notre kit [2],

• Il faut manipuler le contrôle positif comme potentiellement infectieux. Idem pour les échantillons à tester
• Il ne faut pas mélanger les réactifs de différents lots
• Ne pas utiliser le kit après la date d’expiration
• Le kit peut être maintenu en dessous de 30°C pendant son transport, ceci pour une période inférieure à 48 heures. Sinon, il doit être conservé à +2-8°C. Ne pas le congeler.

Après la première utilisation, la plaque de réactifs ne doit pas être utilisée plus de trois fois.

  Limites de la méthode immunocomb

Le test nécessite une minuterie précise, et la présence continuelle du manipulateur devant la plaque, ceci pendant un long moment. Elle est donc laborieuse, surtout si le manipulateur doit effectuer d’autres tâches simultanément.

Il faut toujours faire le test avec les contrôles positifs et négatifs. Ceci peut être couteux si l’on ne teste pas plusieurs patients à la fois.

La plaque ne peut être utilisée plus de trois fois après la première utilisation. Il faut donc rassembler les échantillons dans les petites structures qui n’ont pas beaucoup de patients sinon la méthode devient couteuse. Dans ce cas, le délai dattente des résultats s’allonge aussi.

Bibliographie

1.Atzlabs.(2016). Immunocomb technology, repéré à http://www.atzlabs.com/immunocomb_technical_details_lifetech_india.html

2. Orgenics.(2009). Fiche technique Immunocomb VIH 1 et VIH 2 Bispot

Avertissement: La procédure ci-dessus décrite est un exemple. Pour la rendre applicable dans votre laboratoire, elle doit être validée par votre directeur technique.

Les auteures:

-Rédigé par Renée A. LEYEBE, titulaire d’une Licence en Sciences de la Santé, option Analyses Médicales

-Validé par Petronile NGO ETOUNDE, titulaire d’un Master en Microbiologie et Immunologie.